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培养基经配制和灭菌后，便可进行接种。为避免接种过程中污染杂菌，接种工作要在无菌室或接种箱中进行。无菌室的体积要求不宜过大，一般6～8立方米，能供一、二人操作即可。室内装有紫外线杀菌灯，门窗关闭后里面的空气能与外界隔绝，经消毒就能造成无菌条件。若没有无菌室也可用洁净的小房间代替，但必须进行严格的消毒灭菌。接种箱是代替无菌室的密闭透明小箱。具有体积小，简单轻便，消毒彻底等优点。一般长100厘米，宽60厘米，高50～60厘米，顶部向两边倾斜，安装透明玻璃。箱里装有紫外线杀菌灯，或用福尔马林和高锰酸钾混合熏蒸灭菌，人在箱外，只用两只手伸入箱内进行接种操作，效果好，成功率高。
无菌室和接种箱的灭菌方法，常用的有下列几种：
1.紫外灯灭菌 用于空气中灭菌，30瓦紫外灯距桌面1米照射15分钟或30分钟。
2.化学药品灭菌 所用化学药品的种类甚多，主要的是： （1）70％酒精 用于接种针以及接种人员的手和玻璃器具的表面杀菌。 （2）5％石碳酸 用于空间喷雾灭菌。 （3）0.1％升汞水 用于分离材料的表面消毒。 （4）甲醛溶液 用于空间熏蒸灭菌，可将福尔马林放在瓷器中，直接加热使其蒸发，或于容器中先加入高锰酸钾，其用量为福尔马林重量的10％以上，然后倒入福尔马林，使其蒸发，一般每一立方米体积用10毫升福尔马林即可。
3.火焰灭菌 用于接种针或其他金属用具的灭菌，可直接在酒精灯火焰上烧红。此外，在接种过程中，将试管口，菌种瓶口等采用通过火焰的方式也可达到灭菌的目的。
培养基经灭菌之后，在无菌室或接种箱中，用接种针在酒精灯火焰上，迅速从试管母种中挑一小块带有培养基的菌丝体，放在瓶内的培养基上即成原种。接种后的原种应放在培养室中培养，培养室的大小要适当，过大保温比较困难。四周墙壁用砖砌，石灰粉刷，地面铺水泥，设有通气窗，最好有调温调湿装置，并严格做好消毒灭菌。温度保持在23～26℃之间，培养一个月左右，待菌丝长满全瓶后，即可用来接栽培种。
栽培种的培养基其配制方法和灭菌等大致与原种相同，但装瓶应满些，至瓶肩处为宜。一般每瓶原种可转接栽培种60～80瓶。
